干货分享！比一比，分选细胞您需要多长时间？

细胞分选在多种研究领域都有涉及，例如肿瘤学，神经生物学，免疫学等。上次和大家分享了磁珠分选，除了磁珠分选还有流式分选，今天小编在这里跟大家聊一下流式分选的原理、应用及与磁珠分选的区别，希望能帮到大家一二。

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流式细胞仪分选原理

流式细胞仪分选细胞有两种方法：一是“Catch Tuber"即“捕获管法"就是机械手臂以极快的速度出入样品液流，在细胞通过激光照射并被确认之后快速捕获目标细胞至收集系统中，此种方法常用于小型台式机。另一种方法是电子偏转的方式，即将荧光染色确认的细胞标记正或负电荷，通过电磁场偏转而分离，此种方法常用于大型科研型机器。

电子偏转示意图

操作流程

（1）先制备单细胞悬液（可检测多种样本的单细胞悬液：外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞等）

（2）样本染色

①核酸标记：通过核酸染料DAPI、PI等与核酸（DNA）结合，核酸含量越高，结合的染料越多，故可以通过核酸染料的多少以及强弱进行细胞周期分选。

②蛋白标记：偶联荧光素的单克隆抗体与细胞表面/胞内的抗原结合，结合的量越多，荧光信号就越强。

③荧光报告蛋白：很多报告蛋白是荧光蛋白（GFP、DsRed等），可成为流式检测时荧光信号的来源。

（3）细胞分选

鞘液和样品流进入喷嘴后，在电磁传感器产生的高频振荡下，形成稳定的液滴，然后将荧光染色确认的细胞标记正或负电荷，通过电偏转而分离。

（4）分选后细胞可进一步做分子生物学研究，如荧光定量PCR、western blot、细胞培养等。

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影响流式分选的因素

分选中我们一般都关心分选速度、分选纯度、分选得率、分选活性。

（1）如何提高分选速度：

振荡频率、鞘液压力、喷嘴大小、上样速度

-振荡频率越高，分选速度越快；

-振荡频率越高，鞘液压力也随之增加；

-若要形成稳定液滴，最佳振荡频率：f=V/（4.5d）；

-鞘液压力和喷嘴大小一定时，振荡频率相对固定。

-上样速度过快，得率会降低，故最佳上样速度=1/4*f

（2）如何提高分选纯度：

-精确设定液滴延迟时间（Drop Delay）：指细胞通过激光检测区到液滴分离断电位置的间隔时间。

-保证液流稳定：鞘液和样品流进入喷嘴后，在电磁传感器产生的高频振荡下，形成稳定的液滴，即液流的断点位置维持在一个固定的位置。

-选择合适的分选模式

-排除样本粘连

-合理设门（用散点图）

-合理阈值设定

（3）如何提高分选得率：

- Drop Delay液滴延迟时间要准确，液流稳定

-如果不考虑纯度的情况下（不需后续培养），可以选择Enrich/yield分选模式

（4）如何提高分选活性

-与细胞本身的活性有关

-与仪器洁净程度有关

-与鞘液压力、喷嘴大小有关（对于脆弱细胞，尽量采用低压和大喷嘴，包裹细胞的液滴越大，对细胞的冲击越小）

-与上样管路设计及管壁光滑程度有关

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流式分选和磁珠分选的比较

总结：二者各有优势，不能相互取代。

磁珠分选的优势：

-操作简单、分选速度快、细胞活性好。

流式分选优势：

-多参数分选，不同荧光强度的分选。

二者相互结合，可用于分选比例较低的细胞群。例如要分选人的造血干细胞CD43+CD38-,可以先用磁珠分选富集CD34+细胞，再结合流式分选出CD34+CD38-造血干细胞。

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流式分选的应用

（1）流式分选在干细胞研究中的应用

2013年6月，上海中科院生化所李劲松组、神经所孙强组与健康所金颖组合作，建立来自食蟹猴孤雌囊胚的单倍体胚胎干细胞系，发表在Nature子刊Cell Research上，文中单倍体分选涉及到流式分选。

（2）流式分析在染色体分析分选中的应用

瑞士的一组研究人员建立起一套符合GMP标准的大规模体外扩增异体反应性NK细胞用于AML治疗的实验流程，采用经GMP认证的BD Influx分选出单一KIR（killer lmmunoglobulin-like Receptor）特异性的NK细胞，

（3）流式分析在荧光蛋白分选中的应用

将CFP基因插入到Abcg2基因得到基因改造小鼠，流式分选Abcg2/GFP+骨髓细胞，并移植入小鼠体内检测造血能力，发现：Lin-GFP+细胞显著富集造血干细胞，Lin-GFP-细胞无造血能力。

好了，今天小编给大家详细的介绍了流式分选的原理、应用及与磁珠分选的区别，希望对大家以后的实验有用。