抗痩素纳米抗体制备及筛选

　　瘦素是一种与能量代谢、免疫、生殖等相关的多功能细胞因子，其在血液中的含量异常会导致肥胖、营养不良、心血管疾病、肿瘤、肝病等多种疾病，特别是终末期肾衰患者广泛存在瘦素水平过高的问题，由此导致肾衰症患者营养不良、高血压、胰岛素抵抗等并发症，这些并发症严重影响了患者的生活质量，因此开发特异性抗体实现瘦素水平的检测与去除将具有非常重要的临床意义。纳米抗体由于其诸多优良特点，成为该方面研究的选择。获得足够量的抗原是进行抗体筛选的前提，由于血液中瘦素含量较低，进行了瘦素的制备，然后进行抗体的筛选。研究内容如下：

　　（1）瘦素制备。根据人瘦素氨基酸序列，构建了原核表达载体pET23a-leptin，优化后的表达条件：活化的菌体以1%转接到新鲜培养基后，恒温摇床37℃连续培养8h，期间不加入IPTG。瘦素以包涵体形式存在于大肠杆菌中，通过包涵体的洗涤、溶解、复性、强阴离子交换色谱，获得纯度95%的重组人瘦素蛋白。

　　（2）纳米抗体筛选。通过五轮筛选，从瘦素免疫噬菌体库和非免疫库中分别得到18种和5种特异性纳米抗体序列，因有一序列重复，得到22种。经Elisa方法检测，选取其中结合活性较高的6种进行后续表达纯化。

　　（3）纳米抗体表达。利用PCR、双酶切等手段构建6种纳米抗体的表达载体，转入宿主菌E.coli Shuffle T7进行表达。除纳米抗体A11表达量较低外，纳米抗体A5、A12、A23、A33和B1表达量均可占总蛋白30%，且有可溶性表达。选择A5、A33进行表达纯化，得到纯度达90%的纳米抗体。经Elisa检测对瘦素有结合活性。